Arabidopsis haters club

/bot roskomnadzor

F 10 мг/мл  400 мкл р-ра E  600 мкл
G 5 мг/мл  500 мкл р-ра F  500 мкл
H 0мг/мл  0  1000 мкл

Инкубация в течение 10 минут при 90с
Пробирки охлаждаются, просмотр на Feyond A 300

Ооооо электролитыыыы

1.Листья промыть проточной водой, затем в дистилляте. Хорошо просушить фильтровалкой.
2.Нарезать листья на круги. Должно получиться 0.2г при небольшом разбросе. В 3 повторах.
3.Нарезанные листья промываются в деионизированной воде, просушить на фильтровалке.
4.Помещаются в стеклянные пробирки с 10 мл деионизированной воды, закрываются пробкой.
5.Штатив с пробирками помещается на шейкер. Speed 120. Time 60 min.
6.На ночь в холодильник.
7.След день 1 ч шейкер Speed 120. Time 60 min.
8. Дождаться комнатной температуры.
9.Замеры на кондуктометре.
10.Образцы поместить на водяную баню (100с) 1ч. Снять пробки, плотно накрыть фольгой.
11.После остывания замеры на кондуктометре.

Засуха RWC

1.Подготовить пластиковые пробирки с 10 мл дистиллята.
2.Навесить нарезанные листья по 0.2г (0.1г при малом количестве)
3. Убрать в холодильник на ночь.
4.На след день. Достать из холодильника
5. Просушить на фильтровалке
6.Поместить в бюксы и в сушильный шкаф на 100с (2 часа)
7. Доставать по одной бюксе и взвешивать (Быстро набирают влагу из воздуха)

СОД (updated)

Сток растворы:

1.NBT(НСТ) нитросиний тетразолий
Светочувствителен. Долго растворяется. Жёлтого цвета.
х1 0.02 г в 200мкл спирта и 1800 мкл h2o.
х2 0.04 г в 200 мкл спирта и 1800 мкл h2o.
Хранить в холодильнике без доступа к свету. (2 недели максимум)

2. Рибофлавин (B2 витамин). Оранжевый. Светочувствителен. Растворяется долго. Растворять только в воде.
0.01 г в 2мл H2O.

На 350 мл.
1. 1М Tris - 14 мл
2. L метионин - 0.528 г
3. Х1 NBT - 1.547 мл из стока
4. Рибофлавин - 80.5 мкл из стока
5. Тритон х100 - 87.5 мкл.
6. Довести до 350 мл.

На 100мл
1. ТРИС-Hcl 4 мл 1М (7.8 pH)
2. L-метионин 0.15г + 5мл H2O
3. Нитросиний тетразолий 50мкл
4. Тритон 25 мкл чистого
5. Рибофлавин 50 мкл
6. Довести водой до 100 мл

На 60 мл
1. 1М Tris - 2.4 мл
2. L метионин - 0.09г
3. Х1 NBT - 265 мкл из стока
4. Рибофлавин - 13.8 мкл из стока
5. Тритон х100 - 15 мкл
6. Довести до 60 мл

На 30 мл
1. 1М Tris - 1.2 мл
2. L метионин - 0.045 г
3. Х1 NBT - 132 мкл из стока
4. Рибофлавин - 6.9 мкл из стока
5. Тритон х100 - 7.5 мкл
6. Довести до 30 мл

Анализ
1. К 40 мкл экстракта белка добавить 1960 мкл смеси реагентов.
Контроль 40 мкл H2O + 1960 мкл смеси.

30 минут под лампу, каждые 5 минут проверять. Контрольные должны потемнеть довольно быстро. Образцы могут и не потемнеть вовсе если активность СОД высокая.
Можно использовать меньше экстракта белкового.(?)
Реакция останавливается помещением в темноту. Если снова засветить - краситель развалится.

Измерять при 560 нм.

При стандартом содержании разбавление 3.5 (высушенный образец разбавляется в 500мкл h2o)

При высоком содержании алминокислот, например каллусный материал. Разбавление осуществляется в 7.5 раз. (Высушенный образец с пробоподготовки разбавляется в 1.5 мл H2O)

Калибровочный раствор готовится из концентрата аминокислоты. 50мкл на 950мкл h2o

Анализ капель
254 нм. 22кв.

Фенольные соединения

Реактивы: Na2CO3 20% (разводится без танцев с бубном)
Галловая к-та 0.02 г к 1мл 96% этанола (светочувствителен) (на шейкер)
Реактив Фолена-Чокалтеу в холодильнике (светочувствителен)
1.  К навеске в 0.1 г добавить 1 куб 96% этилового спирта. Взболтать
2.  Инкубация в течение 12 часов в холодильнике.
3.  След день. 1 куб H2O деионизированной.
4.  Шейкер 30 минут.
5.  Центрифугирование 10 минут 10.000-15.000 rpm.
6.  Отбор супернатанта в 1.5 кубовые пробирки
7.  В 2 кубовую пробирку добавить 1680мкл H2O
8.  Добавить 20 мкл супернатанта
9.  100 мкл реактива Фолена-Чокалтеу
10.  200 мкл 20% Na2CO3
11.  Выдержать 30 минут в темноте при комнатной t
12.  Калибровка по Галловой кислоте 0.02 г к 1мл 96% этанола.
13.  Измерение при 760 нм.
Калибровка
  Р-р Галловой к-ты  Этанол 96%
А  4 мг/мл  200 мкл сток  800 мкл
B  2 мг/мл  500 A  500 мкл
C  1 мг/мл  500 B  500 мкл
D  0.5 мг/мл  500 C  500 мкл
E  0.25 мг/мл  500 D  500 мкл
F  0.1 мг/мл  400 E  600 мкл
G  0.05 мг/мл  500 F  500 мкл
H  0.025 мг/мл  500 G  500 мкл
I  0 мг/мл  0  1000 мкл

Флавоноиды

Реактивы:
10% AlCl3 - 10u 100мл h20
1M CH3COONa - 13.6 г CH3COONA на 100 мл H20
0.02 г квертицина на 2 мл этанола (10мг/мл квертицина)
Калибровка   Раствор кверцетина  96% этанол
А  200 мкг/мл  40 мкл  980 мкл
B  100 мкг/мл  20 мкл 0.02мл  980 мкл
C  50 мкг/мл  500 мкл A  500 мкл
D  25 мкг/мл  500 мкл B  500 мкл
E  12.5 мкг/мл  500 мкл C  500 мкл
F  5 мкг/мл  200 мкл D  800 мкл
G  2.5 мкг/мл  500 мкл E  500 мкл
H  1 мкг/мл  200 мкл F  800 мкл
I  0 мкг/мл  0  1000 мкл

1.  К 0.1 г навески добавить 2мл этанола 96%
2.  Инкубация на ночь в холодильнике
3.  200 мкл экстракта + 600 мкл этанола + 40 мкл 1М CH3COONa + 1120 мкл (H2O)
4.  В темноту при комнатной температуре на 30 минут
5. Измерение на 415 нм.

Пигменты

К 0.01г навеске добавляется 1куб 100% ацентона и 2 железных шарика.
Гомогенизатор в течение 1 минуты при 41 попугае.
Шейкер +4с 10 мин 1000 rpm.
Центрифуга +4 с 10 мин при 10000 rpm.
Отбор супернатанта (500мкл) в 1.5 кубовые пробирки.
Добавить в пробирку с осадком 1куб 100% ацетона
Повторить 2 раза
Измерение на НаноДропе при длине волны в 662, 645 и 470 нм при 100% ацетоне.
663, 646 и 470 нм для 80% ацетона.

Сахара и крахмал

2х 2 кубовые пробирки для сахара и крахмала
1х 2 кубовые для калибровки
Антроновый реагент: 0.1г антрона смешивается со 100мл 98% серной кислоты. Отстаивается в течение часа. Приготовление в день анализа.
Глюкоза для калибровки. 0.05г растворяется в 1000мкл дистиллята.
Навеска в 0.1г экстрагируется в 2 мл 80% этанола 15 минут при 80с
Центрифуга обычная 10 минут при 10000 rpm.
Cупернатант отбирается в стеклянные прбирки. Осадок экстрагиурется спиртом еще два раза. Супернатант соединяется с предыдущими фракциями.(экстракт для определения сахара)
100 мкл спиртового экстракта упаривается до сухого состояния.
Осадок растворяется в 100 мкл дистиллята.
————————————————————————————————————————————
К осадку после последней экстракции добавляется 2мл 1% Серной к-ты и инкубируется при 90с в течение 30 минут.
Центрифуга 10000 rpm при 10 min
Супернатант переносится в чистые пробирки(Крахмальный экстракт)
————————————————————————————————————————————
В новые пробирки для сахаров и крахмала добавляется 20 мкл раствора, 480 мкл дистиллята и 1.5 мл антронового реагента.
Калибровка по калибровочному раствору глюкозы 20 мкл, 480 мкл дистиллята и 1.5 мл антронового реагента.
Концентрация   Глюкоза  Вода
А 500мг/мл  0.05  1000 мкл
В 200мг/мл  400 мкл р-ра А  600 мкл
С 100мг/мл  500 мкл р-ра В  500 мкл
D 50 мг/мл  500 мкл р-ра С  500 мкл
E 25 мг/мл  500 мкл р-ра D  500 мкл

•0.2 мМ аскорбиновой кислоты
Сток 100мМ - 35.2 мг на 2мл H2O
Из стока 28 мкл на 10 мл буфера

Кумасси на 50 мл
1. К 0.005 г кумасси добавить 2.5 мл 90% спирта (растворить)
2. Добавить 5мл 85%  H3PO4 (под вытяжкой- это кислота)
3.Довести до 50 мл
Хранится месяц. Использовать через сутки после приготовления. Перед использованием разбавить в 2 раза необходимый объем.

Альбумин для калибровки
25 мг/мл: 0.05г в 2 мл буфера.

Пробоподготовка
1. 0.1 г образца добавить 300 мкл экстракционного буфера.
2. 5 минут шейкер холод (+4С°)
3.Центрифуга 10 минут на холоде 12000 rpm(+4С°)
4. Перенос супернатанта в чистые пробирки.
5. К осадку добавить 300 мкл/200мкл/100мкл в зависимости от вязкости.
Число оборотов 13000/15000/15000
Повтор 3 раза
6. Можно оставить на ночь супернатант в холодильнике.
6.1 Центрифуга 5 минут 15000 rpm

Измерение концентрации белка
Каждый образец в трёх повторах.
1.960 мкл 50мМ K Na фосфатного буфера
2.40 мкл экстракта белка.
3. 1000 мкл кумасси
Измерять при 595 нм.

ППО

Реактивы
50мМ Na-фосфатный буфер (pH 6.5)
50мМ пирокатехин (опасен, растворяется хорошо)

Приготовление
5мл пирокатехина - 0.0275г
10мл пирокатехина - 0.0550г
20мл пирокатехина - 0.1г
25мл пирокатехина - 0.1376г
50мл пирокатехина - 0.2753г
Накладывать пинцетом куски
(В противогазе)

Анализ
1. К 40 мкл белкового экстракта добавить 1960 мкл 50мМ катехола в Na фосфатном буфере.
2. Инкубация при 37С° в течение часа.
Контроль 1960 мкл катехола в фосфатном буфере + 40 мкл H2O

Измерить при 420 нм.

Пероксидаза по Бояркину

Реагенты
0. Бенизидин солянокислый(не растворяется нормально)(опасен)
1. 0.25% раствор солянокислого бензидина.
На 100 мл  250 мг бензидина + 2мл CH3COOH(уксусная кислота) довести до 100 мл H2O. Или
250 мг бензидина растворить в 100 мл 0.2М Na-ацетатного буфера.
2. 0.3% перекись

Анализ
1.К 20 мкл белкового экстракта добавить 980 мкл 0.2 М Na-ацетатного буфера.
2. Добавить 500мкл 0.25% раствора солянокислого бензидина.

Измерение при 590 нм 2 минуты. Инициация реакции путем введения 500мкл 0.3% H2O2.

Гваяколовя пероксидаза

Реактивы
1. Гваякол (опасен)
2. 50мМ раствор K/Na фосфатный буфер. pH 7.4
3.H2O2 0.3% (сток банка 3%)

Анализ
1. На 50 мл - 44.9 мкл гваякола + 1мл спирта, довести до 50 мл буфером.
2. К 40 мкл экстракта добавить 1860 мкл реакционной смеси + буфер, добавить 100мкл 0.3% H2O2
3. Инкубация при 37 С° 30 минут.

Измерение
Длина волны 470 нм. Контроль вместо экстракта вода.

Аминокислоты

Электролит готовится из двух растворов
1. 0.2 М двенадцативодный гидрофосфат натрия 3.582 на 50мл.
(Растворяется на бане, мудовый)
Хранится при комнатке, иначе развалится.
2. 0.2 М моногидрат однозамещённый фосфат натрия 1.38 на 50 мл.
Хранится при комнатке
3. Аминокислоты 0.05г растворяются в 50мл H2O".
[Можно приготовить микс, если совсем нечем заняться в жизни и есть крышечки от водки. 2.5 куба каждой АМК довести до 50мл H2O"]
Полученные разведения так же дериватизируются, как и образцы. (После разведения сухого остатка в 500мкл H2O" и подготовки концентрата. Из него отбирается 50мкл и смешивается с 950 мкл H2O'' - калибровочный раствор.
Электролит
0.1135г b циклодекстрина + 3000 мкл гидрофосфата натрия + 750 мкл дигидрофосфата натрия в 25мл h2o''
(Растворяется на бане)
Реакционные растворы
1. 0.1 М Na2CO3 0.715 г в 25 мл h2o
2. N-фенилизотиционат 200мкл + 12мл изопропилового спирта. (Взболтать)

Пробоподготовка
1.Навеска массой 0.2г + 2 шарика + 1500 мкл 20% спирта.
2. Гомогенезируется
3. Центрифугуется.
4. Отбирается супернатант (1000мкл)
5. К супернатанту (1000 мкл) добавляется 100мкл Na2CO3 и 300мкл фенилизоцианата в изопропиловом спирте.
6. Вортекс.
7. 35 минут при комнатной t.
8. Перенос в чашечки для сушки, полного объема эппендорфа.
9. Сушка 35-40 С в печке. 2 суток как минимум.
10. Сухой осадок соскабливают и разбавляют в 500мкл H2O".
11. Помещают на Вортекс, затем центрифугуют.
[В разбавленном состоянии деградирует.]

Максим:
Тяжёлое выделение РНК

Подготовка 0 день
Пробирки [2 кубовые х2] [2 кубовые х2] [1.5 кубовые х2]
Буфер на 50мл
1. 1.25 г стаб
2. 1.25 г ПВП
3. 5.844 г NaCl
4.трис hcl 1M ph 8.0 - 5мл
5. 25 мл h2o"
Перемешиваем, растворяется сутки
На каждую пробирку с образцом 900мкл буфера
Если образцов 9(2х) то 18 пробирок это 17.5 мкл буфера и 1.75 мкл 10% меркаптана.
Меркаптан добавляется в 50мл пробирку(rna buf) и доводится до 17.5 приготовленным стаб буфером.
День 1
1. Навеска образца в двух повторах по 0.1г. образцы в азоте.
2. Пробирки достаются из азота, по несколько штук. Быстро вносится буфер с меркаптаном (800-900 мкл) и ставится в термостат (66 с) на 30 минут. Перетряхивать все 30 минут.
3. Готовим смесь хлорметана и изоамилового спирта в соотношении 24:1 на 25 мл (0.2:4.2) на 5 мл.
4. Пробирки из термостата переносятся в штатив холодильник
5. Добавляем 900мкл смеси в пробирки
6. Пробирки встряхнуть и поместить в шейкер, хорошо взболтать.
7. Загружаем в центрифугу на +4с 15 минут и 16.0 rcf
8. Чистые пробирки на 2 куба в штатив холодильник. Отбор супернатанта..
9. Добавить аналогичный объем смеси хлороформа и изоамилового спирта .
10. Шейкер 30 секунд
11. Центрифуга  14 минут +4с 16.4 rcf
12. 1.5 кубовые пробирки  в штатив холодильник для остывания . Отбор супернатанта.
13. Добавляем 4M NaCl аналогичный объем. Взбалтываем.
14. Добавляем пропанол аналогичный объем. Взбалтываем.
15. Час в морозилке.
16.Центрифгуа  +4с 35 мин 15.8 rcf
17. Смесь сливаем. Избавляемся от жидкости фильтровалкой. Добавляем 600 мкл ТЕ буфера(500мкл трис hcl 1м +500мкл 100 моль эдта до 50мл h20) и отдельно 9M LiCl 300 мкл.
18. Образцы на ночь в холодильник.
День 2
19. Центрифуга +4 с 1 ч 15.6 rcf
20. Добавляем 300 мкл 70% этилового спирта(из морозилки)
21. Центрифуга +4с 5 минут 16.9 rcf
22. Сливаем надосадочную жидкость
23. Добавляем 300 мкл 70% этиловый спирт(холодный) (35мл чачи , довести до 50мл) = sp 70
24. Центрифуга  +4с 5 минут 16.9 rcf
25. Сливаем надосадочную жидкость.
26. Добавляем 300 мкл 70% спирта
27. Центрифуга +4с 5 минут 16.9 rcf
28. Сливаем надосадочную жидкость
29. Самокруткой избавить РНК от спирта
30. Сушка открытые пробирки кверху вниз 1 час.
31. Depc вода 26 мкл в каждую пробирку. Убираем в холодильник растворятся на ночь.
32. Нанофотометр. Протереть глазок. Рнк. Shoot the bubble. Обнуление на depc. Blank. Измеряем.

MDA

ТБК растворяется в 20% ТХУК на водяной бане при t 60c+
1.К 0.1 г навеске добавляется 2мл 0.5% ТХУК. Взбалтывается.
2.При проведении анализа требуется максимально сохранять охлажденное состояние пробирок с образцами.
3.Шейкер 10 минут +4c 1000 RPM
4.Центрифуга +4с 15 минут 10500 rpm
5.Отбор супернатанта (700 мкл) в винотвые пробирки 2 куба. Супернатант одного образца отбирается в две пробирки(одна для ТХУК, другая для ТБК)
1 ТБК 1ТХУК 1’ТБК 1’ТХУК
6.В пробирки для ТХУК добавляется 1 мл 20% ТХУК
7.В пробирки для ТБК добавляется 0.5% ТБК растворенный в 20% ТХУК.
8.Инкубация в термостате при 95 С в течение 30 минут. После перемешать.
9.Центрифуга +4с 10 минут 10500 rpm.
10.Измерение при длине волны в 532нм 600 нм и 460 нм
Образцы и blank (контроль). ТХУК 20% для образцов с ТХУК. ТБК 0.5% для образцов с ТБК
Раскапывание по 300 мкл в плашки (2 повтора каждый образец)
После завершения Blank subtraction и сохранение каждой длины волны отдельно.

Экстракция белка

Весь анализ на холоде. Пробы не нагревать.

Количество буфера
~0.9 мл буфера экстракционного на один образец
~6 мл буфера фосфатного на калибровку
~3 мл буфера фосфатного на анализ каждого образца

Буфер состоит из
•50 мМ K, Na фосфатного буфера, pH 7.8
[0.2М NaOH - 0.8г в 100мл H²O
0.2M KH2PO4 - 2.72г в 100мл H2O.
45.2 мл NaOH прилить к 50 мл KH2PO4 и довести водой до 200мл. Получаем 0.1М фосфатный буфер. Разбавить водой в два раза чтобы получить 50мМ.]
•PMSF(не навешивается, рандомно сколько прицепится на лопатку, делать под вытяжкой, опасен)
•0.1% тритона Х100 (10мкл на 10 мл буфера) Желеобразный, набирается степпером