Максим:

Тяжёлое выделение РНК

Подготовка 0 день
Пробирки [2 кубовые х2] [2 кубовые х2] [1.5 кубовые х2]
Буфер на 50мл
1. 1.25 г стаб
2. 1.25 г ПВП
3. 5.844 г NaCl
4.трис hcl 1M ph 8.0 - 5мл
5. 25 мл h2o"
Перемешиваем, растворяется сутки
На каждую пробирку с образцом 900мкл буфера
Если образцов 9(2х) то 18 пробирок это 17.5 мкл буфера и 1.75 мкл 10% меркаптана.
Меркаптан добавляется в 50мл пробирку(rna buf) и доводится до 17.5 приготовленным стаб буфером.
День 1
1. Навеска образца в двух повторах по 0.1г. образцы в азоте.
2. Пробирки достаются из азота, по несколько штук. Быстро вносится буфер с меркаптаном (800-900 мкл) и ставится в термостат (66 с) на 30 минут. Перетряхивать все 30 минут.
3. Готовим смесь хлорметана и изоамилового спирта в соотношении 24:1 на 25 мл (0.2:4.2) на 5 мл.
4. Пробирки из термостата переносятся в штатив холодильник
5. Добавляем 900мкл смеси в пробирки
6. Пробирки встряхнуть и поместить в шейкер, хорошо взболтать.
7. Загружаем в центрифугу на +4с 15 минут и 16.0 rcf
8. Чистые пробирки на 2 куба в штатив холодильник. Отбор супернатанта..
9. Добавить аналогичный объем смеси хлороформа и изоамилового спирта .
10. Шейкер 30 секунд
11. Центрифуга  14 минут +4с 16.4 rcf
12. 1.5 кубовые пробирки  в штатив холодильник для остывания . Отбор супернатанта.
13. Добавляем 4M NaCl аналогичный объем. Взбалтываем.
14. Добавляем пропанол аналогичный объем. Взбалтываем.
15. Час в морозилке.
16.Центрифгуа  +4с 35 мин 15.8 rcf
17. Смесь сливаем. Избавляемся от жидкости фильтровалкой. Добавляем 600 мкл ТЕ буфера(500мкл трис hcl 1м +500мкл 100 моль эдта до 50мл h20) и отдельно 9M LiCl 300 мкл.
18. Образцы на ночь в холодильник.
День 2
19. Центрифуга +4 с 1 ч 15.6 rcf
20. Добавляем 300 мкл 70% этилового спирта(из морозилки)
21. Центрифуга +4с 5 минут 16.9 rcf
22. Сливаем надосадочную жидкость
23. Добавляем 300 мкл 70% этиловый спирт(холодный) (35мл чачи , довести до 50мл) = sp 70
24. Центрифуга  +4с 5 минут 16.9 rcf
25. Сливаем надосадочную жидкость.
26. Добавляем 300 мкл 70% спирта
27. Центрифуга +4с 5 минут 16.9 rcf
28. Сливаем надосадочную жидкость
29. Самокруткой избавить РНК от спирта
30. Сушка открытые пробирки кверху вниз 1 час.
31. Depc вода 26 мкл в каждую пробирку. Убираем в холодильник растворятся на ночь.
32. Нанофотометр. Протереть глазок. Рнк. Shoot the bubble. Обнуление на depc. Blank. Измеряем.

MDA

ТБК растворяется в 20% ТХУК на водяной бане при t 60c+
1.К 0.1 г навеске добавляется 2мл 0.5% ТХУК. Взбалтывается.
2.При проведении анализа требуется максимально сохранять охлажденное состояние пробирок с образцами.
3.Шейкер 10 минут +4c 1000 RPM
4.Центрифуга +4с 15 минут 10500 rpm
5.Отбор супернатанта (700 мкл) в винотвые пробирки 2 куба. Супернатант одного образца отбирается в две пробирки(одна для ТХУК, другая для ТБК)
1 ТБК 1ТХУК 1’ТБК 1’ТХУК
6.В пробирки для ТХУК добавляется 1 мл 20% ТХУК
7.В пробирки для ТБК добавляется 0.5% ТБК растворенный в 20% ТХУК.
8.Инкубация в термостате при 95 С в течение 30 минут. После перемешать.
9.Центрифуга +4с 10 минут 10500 rpm.
10.Измерение при длине волны в 532нм 600 нм и 460 нм
Образцы и blank (контроль). ТХУК 20% для образцов с ТХУК. ТБК 0.5% для образцов с ТБК
Раскапывание по 300 мкл в плашки (2 повтора каждый образец)
После завершения Blank subtraction и сохранение каждой длины волны отдельно.

Экстракция белка

Весь анализ на холоде. Пробы не нагревать.

Количество буфера
~0.9 мл буфера экстракционного на один образец
~6 мл буфера фосфатного на калибровку
~3 мл буфера фосфатного на анализ каждого образца

Буфер состоит из
•50 мМ K, Na фосфатного буфера, pH 7.8
[0.2М NaOH - 0.8г в 100мл H²O
0.2M KH2PO4 - 2.72г в 100мл H2O.
45.2 мл NaOH прилить к 50 мл KH2PO4 и довести водой до 200мл. Получаем 0.1М фосфатный буфер. Разбавить водой в два раза чтобы получить 50мМ.]
•PMSF(не навешивается, рандомно сколько прицепится на лопатку, делать под вытяжкой, опасен)
•0.1% тритона Х100 (10мкл на 10 мл буфера) Желеобразный, набирается степпером