Новое Распределяем каналы MAX по категориям и территориям. Читать новость
Открытый канал ID 74320460603576

КапСек

Канал о фрагментном анализе и секвенировании по Сенгеру. Случаи из практики, проблемы и пути их решения.
max.ru/channel_CapSeq

Открыть в MAX

Публикации за период

По реакциям

Поиск и вся лента — после бесплатной регистрации. Свои даты — по подписке; владелец канала видит их бесплатно. Сортировка по реакциям — по подписке. Зарегистрироваться

Загрузка…

Планшеты для капиллярных секвенаторов на рынке представлены довольно широко. Можно сходу назвать нескольких производителей.
И все они "ABI-совместимые", "с полуюбкой" и т.д.

Однако по своим размерам планшеты могут отличаться и при переходе с одного "пластика" на другой бывают ситуации, когда настройки движения автосэмплера не подходят под данный вариант планшета.

Необходимо вернуться к работе с предыдущим планшетом, либо вызывать специалиста для настройки работы автосэмплера.
Берегите себя и оборудование.

КапСек - просто о капиллярном секвенировании.


#пластик
Просмотры: 26
Перейти в пост Открыть в MAX Сообщить о неточности
Представьте ситуацию:

🧩 Инсталлировали прибор: установили капиллярную сборку и емкости с буферами, заполнили систему полимером

🧩 Провели пространственную и спектральную калибровки

🧩 Подготовили образцы на электрофорез в формате HID

🧩 Установили плашку в прибор, написали протокол в ПО, начали связывать их и... прибор выдаёт сообщение "Plate Setup Error"

#электрофорез
Просмотры: 102
Перейти в пост Открыть в MAX Сообщить о неточности
Появление артефактов («dye blobs» или «пятен красителя») в образце аллельного леддера при капиллярном электрофорезе.

Симптомы: на электрофореграмме леддера появляются лишние пики, которые не являются аллелями ДНК.

Возможная причина: эти пятна являются артефактами, возникающими из-за неполного включения красителя в праймеры при синтезе или при хранении реагентов.

☝️ Для анализа следует использовать только высококачественные аллельные леддеры.
Если леддер выглядит «грязным» или имеет низкое качество, его следует заменить.

#электрофорез
Просмотры: 110
Перейти в пост Открыть в MAX Сообщить о неточности
Спектральная калибровка - это не проверка качества сигнала, а построение матрицы пересчёта между перекрывающимися спектрами красителей. Программа не «узнает» краситель по форме пика на электрофореграмме - она раскладывает суммарный сигнал по заранее заданным эталонным спектрам (Dye Set).

Поэтому перед проведением спектральной калибровки необходимо проверить соответствие между матричным стандартом (реагентом) и набором красителей (Dye Set) в соответствии с инструкцией к реагенту.

При несоответствии алгоритм программы не сможет адекватно определить красители, даже если сырые данные были идеальные: высокий сигнал, ровные пики, низкий фон (фото 1).

На фото 2 результат неверно выбранного DyeSet для данного сиквенсового стандарта

#калибровка
Просмотры: 96
Перейти в пост Открыть в MAX Сообщить о неточности
Иногда при проведении спектральной калибровки картинка сырых данных может обескураживать - то высоты сигналов красителей разные или вообще один или несколько сигналов "уходят" ниже горизонтальной оси (фото 1)

✔️ Если высоты разные, то на идентификации цвета красителя это никак не скажется, но стоит обратить внимание на высоты сигналов красителей в аллельном леддере.

✔️ Если сигнал ушел вниз, то важно дождаться завершения процесса калибровки и оценить коэффициенты качества в таблице.
Как правило, сама программа прибора отмечает красным маркером те капилляры, где прошло неудачно.

- если сигнал ушёл вниз, но по завершении калибровки результат оценен на "отлично", то это означает, что внесенного объема калибратора очень много, но тем не менее "математика" программы справилась и отсекла лишнее (фото 2)

- если сигнал/сигналы направлены вниз и результат калибровки неудовлетворительный, то матричного стандарта внесено слишком много.
☝️ Необходимо разбавить калибровочный микс и переставить калибровку.

#калибровка
Просмотры: 94
Перейти в пост Открыть в MAX Сообщить о неточности
"Детектор в секвенаторе чёрно-белый. Как он различает цвета красителей?"

В капиллярных секвенаторах используют монохромные матрицы - CCD и CMOS. Это не «цветные камеры» в бытовом смысле: они регистрируют не готовую цветную картинку, а интенсивность света в каждой точке сенсора.

Принцип работы основан на лазерно-индуцированной флуоресценции. Лазер возбуждает флуоресцентные красители, которыми помечены фрагменты ДНК. Краситель, излучает свет с определённой длиной волны. Оптическая система (призма или дифракционная решётка) разделяет этот смешанный свет на спектральные составляющие, а монохромный сенсор измеряет интенсивность сигнала в соответствующих областях. «Цвет» здесь определяется не камерой, а оптикой и спектральным разделением.

#секвенатор
Просмотры: 109
Перейти в пост Открыть в MAX Сообщить о неточности
Но не все неясные сигналы являются следствием нарушения поверхности капилляра. Перед тем как списывать "аномалию" на дефект капилляра, нужно исключить банальные причины - загрязнение реактивов.

На фото показано, что во время калибровки вместо одного сигнала оранжевого красителя выявлены множественные сигналы.

Было установлено, что используемый формамид ранее был смешан с размерным стандартом и хранился без обозначения этого.

☝️ Любые миксы реагентов обязательно необходимо маркировать на пробирке

#калибровка #капсборка
Просмотры: 111
Перейти в пост Открыть в MAX Сообщить о неточности
Однако не спешите менять сборку, если отключился один или два капилляра, без которых Вы можете обойтись.

Эксперимент показал, что, проводя форез объектов
по другим капиллярам,
в "пробитом" капилляре тоже происходит обновление пригоревшего полимера на новый.

Да, происходит это не быстро, на это может уйти до 10-15 форезов, но тем не менее это возможно.

На фото 1-4 последовательно показаны этапы восстановления капилляра.

PS: эта капсборка отработала свой положенный срок и даже больше 😊

#секвенатор #электрофорез
Просмотры: 139
Перейти в пост Открыть в MAX Сообщить о неточности
На капиллярной сборке пробой тоже отражается - он выводит из строя один или несколько капилляров.

Происходит так:
⚡ сперва меченные красителем ПЦР-продукты детектируются (фото 1), еще можно провести несколько форезов,
⚡ а потом в следующей постановке происходит резкое "отключение" капилляра/капилляров - сигналы с ПЦР-продуктов перестают детектироваться (фото 2),
⚡ вплоть до отсутствия шумового сигнала (фото 3)

И тут возникает дилемма
"Что же делать?!"
особенно если новую сборку недавно поставили в прибор

#секвенатор #электрофорез
Просмотры: 118
Перейти в пост Открыть в MAX Сообщить о неточности
Вся лента — после бесплатной регистрации
ВКонтакте Телеграм Одноклассники
Избранное в datool.ru

Следите за каналом в личном кабинете

Зарегистрируйтесь в datool.ru, чтобы добавить канал «КапСек» в избранное и отслеживать его показатели.

Зарегистрироваться
Для владельцев каналов

Подтвердите свой канал

Войдите или зарегистрируйтесь в datool.ru, затем добавьте нашего бота в канал по инструкции в личном кабинете. После проверки владения замок исчезнет и вам станет доступно управление каналом.

Войти или зарегистрироваться

Сообщить о неточности

Опишите, что нужно исправить. Если есть источник, добавьте ссылку.

Вы покидаете datool.ru

Ссылка ведёт на внешний сайт. datool.ru не отвечает за его содержимое — проверьте адрес, прежде чем вводить пароли или платёжные данные.

Переход через 10 с

Перейти