Новое Распределяем каналы MAX по категориям и территориям. Читать новость
Открытый канал ID 74320460603576

КапСек

Канал о фрагментном анализе и секвенировании по Сенгеру. Случаи из практики, проблемы и пути их решения.
max.ru/channel_CapSeq

Открыть в MAX

Публикации за период

По реакциям

Поиск и вся лента — после бесплатной регистрации. Свои даты — по подписке; владелец канала видит их бесплатно. Сортировка по реакциям — по подписке. Зарегистрироваться

Загрузка…

Представьте ситуацию:

🧩 Инсталлировали прибор: установили капиллярную сборку и емкости с буферами, заполнили систему полимером

🧩 Провели пространственную и спектральную калибровки

🧩 Подготовили образцы на электрофорез в формате HID

🧩 Установили плашку в прибор, написали протокол в ПО, начали связывать их и... прибор выдаёт сообщение "Plate Setup Error"

#электрофорез
Просмотры: 82
Перейти в пост Открыть в MAX Сообщить о неточности
Загружаем изображение…
Загружаем изображение…
Загружаем изображение…
Появление артефактов («dye blobs» или «пятен красителя») в образце аллельного леддера при капиллярном электрофорезе.

Симптомы: на электрофореграмме леддера появляются лишние пики, которые не являются аллелями ДНК.

Возможная причина: эти пятна являются артефактами, возникающими из-за неполного включения красителя в праймеры при синтезе или при хранении реагентов.

☝️ Для анализа следует использовать только высококачественные аллельные леддеры.
Если леддер выглядит «грязным» или имеет низкое качество, его следует заменить.

#электрофорез
Просмотры: 106
Перейти в пост Открыть в MAX Сообщить о неточности
Загружаем изображение…
Загружаем изображение…
Спектральная калибровка - это не проверка качества сигнала, а построение матрицы пересчёта между перекрывающимися спектрами красителей. Программа не «узнает» краситель по форме пика на электрофореграмме - она раскладывает суммарный сигнал по заранее заданным эталонным спектрам (Dye Set).

Поэтому перед проведением спектральной калибровки необходимо проверить соответствие между матричным стандартом (реагентом) и набором красителей (Dye Set) в соответствии с инструкцией к реагенту.

При несоответствии алгоритм программы не сможет адекватно определить красители, даже если сырые данные были идеальные: высокий сигнал, ровные пики, низкий фон (фото 1).

На фото 2 результат неверно выбранного DyeSet для данного сиквенсового стандарта

#калибровка
Просмотры: 92
Перейти в пост Открыть в MAX Сообщить о неточности
Загружаем изображение…
Загружаем изображение…
Иногда при проведении спектральной калибровки картинка сырых данных может обескураживать - то высоты сигналов красителей разные или вообще один или несколько сигналов "уходят" ниже горизонтальной оси (фото 1)

✔️ Если высоты разные, то на идентификации цвета красителя это никак не скажется, но стоит обратить внимание на высоты сигналов красителей в аллельном леддере.

✔️ Если сигнал ушел вниз, то важно дождаться завершения процесса калибровки и оценить коэффициенты качества в таблице.
Как правило, сама программа прибора отмечает красным маркером те капилляры, где прошло неудачно.

- если сигнал ушёл вниз, но по завершении калибровки результат оценен на "отлично", то это означает, что внесенного объема калибратора очень много, но тем не менее "математика" программы справилась и отсекла лишнее (фото 2)

- если сигнал/сигналы направлены вниз и результат калибровки неудовлетворительный, то матричного стандарта внесено слишком много.
☝️ Необходимо разбавить калибровочный микс и переставить калибровку.

#калибровка
Просмотры: 90
Перейти в пост Открыть в MAX Сообщить о неточности
Загружаем изображение…
"Детектор в секвенаторе чёрно-белый. Как он различает цвета красителей?"

В капиллярных секвенаторах используют монохромные матрицы - CCD и CMOS. Это не «цветные камеры» в бытовом смысле: они регистрируют не готовую цветную картинку, а интенсивность света в каждой точке сенсора.

Принцип работы основан на лазерно-индуцированной флуоресценции. Лазер возбуждает флуоресцентные красители, которыми помечены фрагменты ДНК. Краситель, излучает свет с определённой длиной волны. Оптическая система (призма или дифракционная решётка) разделяет этот смешанный свет на спектральные составляющие, а монохромный сенсор измеряет интенсивность сигнала в соответствующих областях. «Цвет» здесь определяется не камерой, а оптикой и спектральным разделением.

#секвенатор
Просмотры: 106
Перейти в пост Открыть в MAX Сообщить о неточности
Загружаем изображение…
Но не все неясные сигналы являются следствием нарушения поверхности капилляра. Перед тем как списывать "аномалию" на дефект капилляра, нужно исключить банальные причины - загрязнение реактивов.

На фото показано, что во время калибровки вместо одного сигнала оранжевого красителя выявлены множественные сигналы.

Было установлено, что используемый формамид ранее был смешан с размерным стандартом и хранился без обозначения этого.

☝️ Любые миксы реагентов обязательно необходимо маркировать на пробирке

#калибровка #капсборка
Просмотры: 108
Перейти в пост Открыть в MAX Сообщить о неточности
Загружаем изображение…
Загружаем изображение…
Загружаем изображение…
Нарушение внутренней поверхности капилляров невидимо глазом, но выявляется при постановке электрофореза

#капсборка
Просмотры: 105
Перейти в пост Открыть в MAX Сообщить о неточности
Загружаем изображение…
Загружаем изображение…
Загружаем изображение…
Загружаем изображение…
Однако не спешите менять сборку, если отключился один или два капилляра, без которых Вы можете обойтись.

Эксперимент показал, что, проводя форез объектов
по другим капиллярам,
в "пробитом" капилляре тоже происходит обновление пригоревшего полимера на новый.

Да, происходит это не быстро, на это может уйти до 10-15 форезов, но тем не менее это возможно.

На фото 1-4 последовательно показаны этапы восстановления капилляра.

PS: эта капсборка отработала свой положенный срок и даже больше 😊

#секвенатор #электрофорез
Просмотры: 137
Перейти в пост Открыть в MAX Сообщить о неточности
Загружаем изображение…
Загружаем изображение…
Загружаем изображение…
На капиллярной сборке пробой тоже отражается - он выводит из строя один или несколько капилляров.

Происходит так:
⚡ сперва меченные красителем ПЦР-продукты детектируются (фото 1), еще можно провести несколько форезов,
⚡ а потом в следующей постановке происходит резкое "отключение" капилляра/капилляров - сигналы с ПЦР-продуктов перестают детектироваться (фото 2),
⚡ вплоть до отсутствия шумового сигнала (фото 3)

И тут возникает дилемма
"Что же делать?!"
особенно если новую сборку недавно поставили в прибор

#секвенатор #электрофорез
Просмотры: 116
Перейти в пост Открыть в MAX Сообщить о неточности
Загружаем изображение…
Загружаем изображение…
Если все-таки момент с проверкой пузырей воздуха пропустили и запустили форез, то может быть все обойдётся??!

Увы, нет.
На комплектующих прибора это скажется в виде нагара или оплавления в месте соприкосновения воздуха
с поверхностью.

Воздействие электрического пробоя нарушает целостность поверхности, образуются микротрещины, приводящие к сокращению срока эксплуатации деталей.

#секвенатор
Просмотры: 116
Перейти в пост Открыть в MAX Сообщить о неточности
Вся лента — после бесплатной регистрации
ВКонтакте Телеграм Одноклассники
Избранное в datool.ru

Следите за каналом в личном кабинете

Зарегистрируйтесь в datool.ru, чтобы добавить канал «КапСек» в избранное и отслеживать его показатели.

Зарегистрироваться
Для владельцев каналов

Подтвердите свой канал

Войдите или зарегистрируйтесь в datool.ru, затем добавьте нашего бота в канал по инструкции в личном кабинете. После проверки владения замок исчезнет и вам станет доступно управление каналом.

Войти или зарегистрироваться

Сообщить о неточности

Опишите, что нужно исправить. Если есть источник, добавьте ссылку.

Вы покидаете datool.ru

Ссылка ведёт на внешний сайт. datool.ru не отвечает за его содержимое — проверьте адрес, прежде чем вводить пароли или платёжные данные.

Переход через 10 с

Перейти